Ajustes a qualquer um dos componentes de uma reação de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) podem alterar a qualidade do resultado, melhorando ou diminuindo o rendimento e a qualidade do produto ou melhorando a especificidade e a sensibilidade da reação. Os parâmetros que influenciam o resultado final podem ser físicos (isto é, temperatura, tempos de ciclo) ou químicos (isto é, concentração do modelo, tipo de enzima usada). A seguir estão vários fatores-chave que influenciam o sucesso da PCR.
01 Condições Laboratoriais Limpas
Como a PCR é capaz de detectar uma única molécula de DNA, é importante manter as condições primitivas no laboratório. Use sempre luvas novas, use material de vidro estéril, tubos e pontas de pipetas e soluções estéreis, e limpe a área de trabalho antes de começar a trabalhar.
Sempre inclua reações de controle, sem DNA molde e sem enzima, para garantir que os resultados sejam realmente devidos à amplificação da amostra correta.
A maioria das pessoas certifica-se de ter seu próprio conjunto de soluções que não são compartilhadas para facilitar a solução de problemas e as pipetas designadas geralmente são reservadas apenas para PCR. Tubos de PCR DNase e RNase-free, pontas de pipeta resistentes a aerossol e trabalhando em um exaustor com luz UV também são formas de minimizar os problemas.
02 Componentes Químicos
- Tem 18 a 24 bases
- Não tem estrutura secundária (por exemplo, loops de hairpin)
- Tem distribuição equilibrada de pares G / C e A / T
- Não são complementares uns aos outros nas extremidades de 3 pés
- Tem temperaturas de fusão (Tm) de cerca de 5-10 graus Celsius abaixo da temperatura de recozimento, que é geralmente entre 55 e 65 graus Celsius
O Tm para ambos os primers também deve ser similar para melhores resultados.
03 Mix de Reação: Template e Primers
As concentrações ótimas de primers estão entre 0,1 e 0,6 micromoles / L. A quantidade de molde varia dependendo do tipo de DNA (humano, bacteriano, plasmídeo).
Com quantidades muito baixas de modelos, existem outras estratégias para melhorar os resultados, como o aumento do número de ciclos ou o uso de "início a quente". Sempre teste novos primers com uma reação de controle positiva, para ter certeza de que eles funcionam sob suas condições experimentais específicas.
04 Reaction Mix: Enzyme Activity
A concentração de MgCl2 na mistura de reação pode influenciar o resultado da PCR e pode desempenhar um papel importante em reações mais exigentes. O cátion magnésio forma complexos solúveis com dNTPs para produzir o substrato real que a enzima polimerase reconhece.
Quantidades iguais de todos os quatro dNTPs também ajudam a reduzir a taxa de erro de polimerase. Certos aditivos, como betaína, BSA, detergentes, DMSO, glicerol e pirofosfatase também podem afetar a especificidade da enzima ou a eficiência da reação.
05 Tipo de termociclador
Ao comprar equipamentos de laboratório, tenha em mente que alguns termocicladores são menos precisos do que outros na manutenção de temperaturas exatas e desejadas.
Esta é uma área onde ir barato não vai pagar a longo prazo quando você se depara com uma reação mimada ou usando primers que requerem uma faixa estreita de temperatura de recozimento.
Tubos de reação de paredes finas projetados para se adequar à marca precisa do termociclador que você está usando, também ajudam a otimizar as temperaturas de reação.
06 configurações do ciclo
O aumento do rendimento pode ser alcançado aumentando o tempo de extensão a cada 20 ciclos, para compensar menos enzimas para amplificar mais modelos. Geralmente, menos de 40 ciclos são suficientes para amplificar menos de 10 moléculas modelo para uma concentração grande o suficiente para ver em um gel de agarose corado com brometo de etídio.