A clonagem de genes é o ato de fazer cópias, ou clones, de um único gene. Uma vez identificado um gene, os clones podem ser usados em muitas áreas da pesquisa biomédica e industrial. A engenharia genética é o processo de clonagem de genes em novos organismos ou alteração da sequência de DNA para alterar o produto proteico. A engenharia genética depende da nossa capacidade de realizar os seguintes procedimentos essenciais.
01 reação em cadeia da polimerase
02 Enzimas de Restrição
A descoberta de enzimas conhecidas como endonucleases de restrição tem sido essencial para a engenharia de proteínas . Essas enzimas cortam o DNA em locais específicos com base na seqüência de nucleotídeos. Centenas de diferentes enzimas de restrição , capazes de cortar o DNA em um local distinto, foram isoladas de muitas linhagens diferentes de bactérias. O DNA cortado com uma enzima de restrição produz muitos fragmentos menores, de tamanhos variados. Estes podem ser separados usando eletroforese em gel ou cromatografia.
03 Eletroforese
Purificar o DNA de uma cultura de células ou cortá-lo usando enzimas de restrição não seria de grande utilidade se não conseguíssemos visualizar o DNA - isto é, encontrar uma maneira de ver se seu extrato contém alguma coisa ou quais fragmentos de tamanho você cortei em. Uma maneira de fazer isso é por eletroforese em gel. Os géis são usados para uma variedade de propósitos, desde ver o DNA cortado até detectar inserções de DNA e nocautes.
04 Junte-se a dois pedaços de DNA
Na pesquisa genética, muitas vezes é necessário ligar duas ou mais fitas individuais de DNA, para criar uma fita recombinante, ou fechar uma fita circular que foi cortada com enzimas de restrição. Enzimas chamadas de DNA ligases podem criar ligações covalentes entre cadeias de nucleotídeos. As enzimas DNA polimerase I e polinucleotídeo quinase também são importantes neste processo, para preencher lacunas ou fosforilar as extremidades 5 ', respectivamente.
05 Seleção de DNA de auto-replicação pequena
Pequenos pedaços circulares de DNA que não fazem parte de um genoma bacteriano, mas são capazes de auto-replicação, são conhecidos como plasmídeos. Plasmídeos são frequentemente usados como vetores para transportar genes entre microorganismos. Em biotecnologia, uma vez que o gene de interesse foi amplificado e tanto o gene quanto o plasmídeo são cortados por enzimas de restrição, eles são ligados entre si gerando o que é conhecido como DNA recombinante. O DNA viral (bacteriófago) também pode ser usado como vetor, assim como cosmídeos, plasmídeos recombinantes contendo genes de bacteriófagos.
06 Método para mover um vetor para uma célula host
O processo de transferir material genético em um vetor, como um plasmídeo, para novas células hospedeiras, é chamado de transformação. Esta técnica requer que as células hospedeiras sejam expostas a uma mudança ambiental que as torne "competentes" ou temporariamente permeáveis ao vetor. A eletroporação é uma dessas técnicas. Quanto maior o plasmídeo, menor a eficiência com a qual ele é absorvido pelas células. Segmentos de DNA maiores são mais facilmente clonados usando bacteriófagos, retrovírus ou outros vetores virais ou cosmídeos em um método chamado transdução. Os fagos ou vetores virais são frequentemente usados na medicina regenerativa, mas podem causar a inserção de DNA em partes de nossos cromossomos onde não queremos, causando complicações e até câncer.
07 Métodos para Seleção de Organismos Transgênicos
Nem todas as células irão absorver DNA durante a transformação. É essencial que haja um método de detectar aqueles que o fazem. Geralmente, os plasmeos transportam genes para resistcia a antibiicos e as culas transgicas podem ser seleccionadas com base na express desses genes e na sua capacidade de crescer em meios contendo esse antibiico. Os métodos alternativos de selecção dependem da presença de outras proteínas repórter, tais como o sistema x-gal / lacZ ou a proteína de fluorescência verde, que permitem a selecção com base na cor e na fluorescência, respectivamente.