O que PCR tem a ver com sequenciamento de DNA e amplificação de genes
A reação em cadeia da polimerase ( PCR ) é uma técnica genética molecular para fazer múltiplas cópias de um gene e também faz parte do processo de seqüenciamento gênico.
Como funciona a reação em cadeia da polimerase?
Cópias genéticas são feitas usando uma amostra de DNA, e a tecnologia é boa o suficiente para fazer várias cópias de uma única cópia do gene encontrado na amostra. A amplificao por PCR de um gene para fazer milhs de cias permite a deteco e identificao de sequcias genicas utilizando tnicas visuais baseadas no tamanho e carga (+ ou -) do fragmento de ADN.
Sob condições controladas, pequenos segmentos de DNA são gerados por enzimas conhecidas como DNA polimerases, que adicionam deoxinucleotídeos complementares (dNTPs) a um fragmento de DNA conhecido como "template". Mesmo pequenos pedaços de DNA, chamados "primers", são usados como ponto de partida para a polimerase. Primers são pequenos fragmentos de DNA feitos pelo homem (oligômeros), geralmente com 15 a 30 nucleotídeos de comprimento. Eles são feitos conhecendo ou adivinhando seqüências curtas de DNA nas extremidades do gene que está sendo amplificado. Durante a PCR, o DNA que está sendo sequenciado é aquecido e os filamentos duplos são separados. Após o resfriamento, os primers se ligam ao modelo (chamado de recozimento) e criam um local para o início da polimerase.
A técnica de PCR
A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi possível graças à descoberta de termofílicos e enzimas polimerases termofílicas (enzimas que mantêm a integridade estrutural e funcionalidade após o aquecimento em altas temperaturas).
Os passos envolvidos na técnica de PCR são os seguintes:
- Uma mistura é criada, com concentrações otimizadas do molde de DNA, enzima polimerase, primers e dNTPs. A capacidade de aquecer a mistura sem desnaturar a enzima permite a desnaturação da dupla hélice da amostra de DNA a temperaturas na faixa de 94 graus Celsius.
- Após a desnaturação, a amostra é resfriada a uma faixa mais moderada, em torno de 54 graus, o que facilita o emparelhamento (ligação) dos primers com os moldes de DNA de fita simples.
- Na terceira etapa do ciclo, a amostra é reaquecida a 72 graus, a temperatura ideal para Taq DNA Polymerase, para alongamento. Durante o alongamento, a polimerase de ADN utiliza a cadeia simples original de ADN como molde para adicionar dNTP complementares às extremidades 3 'de cada iniciador e gerar uma secção de ADN de cadeia dupla na região do gene de interesse.
- Os primers que se ligaram a seqüências de DNA que não são uma correspondência exata não permanecem recozidos a 72 graus, limitando assim o alongamento ao gene de interesse.
Este processo de desnaturação, recozimento e alongamento são repetidos múltiplos (30-40) vezes, aumentando assim exponencialmente o número de cópias do gene desejado na mistura. Embora este processo seja bastante tedioso se realizado manualmente, as amostras podem ser preparadas e incubadas em um Thermocycler programável, agora comum na maioria dos laboratórios moleculares, e uma reação completa de PCR pode ser realizada em 3-4 horas.
Cada passo de desnaturação interrompe o processo de alongamento do ciclo anterior, truncando assim o novo filamento de DNA e mantendo-o aproximadamente ao tamanho do gene desejado.
A duração do ciclo de alongamento pode ser maior ou menor dependendo do tamanho do gene de interesse, mas, eventualmente, através de ciclos repetidos de PCR, a maioria dos modelos será restrita ao tamanho do gene de interesse sozinho, pois terá sido gerado a partir de produtos de ambos os primers.
Existem vários fatores diferentes para o sucesso da PCR que podem ser manipulados para melhorar os resultados. O método mais amplamente utilizado para testar a presença de produto de PCR é a eletroforese em gel de agarose . Que é usado para separar fragmentos de DNA com base no tamanho e na carga. Os fragmentos são então visualizados usando corantes ou radioisótopos.
A evolução
Desde a descoberta da PCR, DNA polimerases diferentes da Taq original foram descobertas. Alguns deles têm melhor capacidade de revisão ou são mais estáveis em temperaturas mais altas, melhorando assim a especificidade da PCR e reduzindo os erros da inserção do dNTP incorreto.
Algumas variações da PCR foram projetadas para aplicações específicas e agora são usadas regularmente em laboratórios de genética molecular. Alguns destes são PCR em tempo real e PCR de transcriptase reversa. A descoberta da PCR também levou ao desenvolvimento de sequenciamento de DNA, fingerprinting de DNA e outras técnicas moleculares.