Desenvolvido em 1983, o processo de PCR tornou possível realizar sequenciamento de DNA e identificar a ordem dos nucleotídeos em genes individuais.
O método utiliza ciclos térmicos ou o aquecimento e resfriamento repetidos da reação para a fusão e replicação do DNA. À medida que a PCR continua, o “novo” DNA é usado como modelo para a replicação e uma reação em cadeia se inicia, amplificando exponencialmente o modelo de DNA.
As técnicas de PCR são aplicadas em muitas áreas da biotecnologia, incluindo engenharia de proteínas , clonagem, perícia forense (DNA fingerprinting), testes de paternidade, diagnóstico de doenças hereditárias e / ou infecciosas e análise de amostras ambientais.
Em análise forense, em particular, a PCR é especialmente útil porque amplifica até mesmo a menor quantidade de evidências de DNA. A PCR também pode ser usada para analisar DNA com milhares de anos de idade, e essas técnicas foram usadas para identificar tudo, desde um mamute de 800 mil anos até múmias de todo o mundo.
O procedimento de PCR é o seguinte:
- Inicialização: Esta etapa é necessária apenas para DNA polimerases que requerem PCR de início a quente. A reaco aquecida a entre 94 e 96 e mantida durante 1-9 minutos.
- Desnaturação: Se o procedimento não exigir inicialização, a desnaturação é o primeiro passo. A reaco aquecida a 94-98 durante 20-30 segundos. As ligações de hidrogénio do modelo de ADN são interrompidas e são criadas moléculas de ADN de cadeia simples.
- Recozimento: A temperatura de reação é menor entre 50 e 65 ° C e mantida por 20-40 segundos. Os primers se ligam ao modelo de DNA de fita simples. A temperatura é extremamente importante durante esta etapa. Se estiver muito quente, o primer pode não se ligar. Se estiver muito frio, o primer pode se ligar imperfeitamente. Uma boa ligação é formada quando a sequência do primer corresponde de perto à sequência do modelo.
- Extensão / Alongamento: A temperatura durante este passo varia dependendo do tipo de polimerase. A DNA polimerase sintetiza uma fita de DNA completamente nova.
- Alongamento final: Este passo é realizado a 70-74 ° C durante 5-15 minutos após o ciclo de PCR final.
- Retenção final: esta etapa é opcional. A temperatura é mantida a 4-15 ° C e encobre a reação.
O procedimento é dividido em três etapas:
- Amplificação exponencial: durante cada ciclo, o produto (o pedaço específico de DNA que está sendo replicado) é duplicado.
- Estágio de nivelamento: Como a DNA polimerase perde atividade e consome reagentes, a reação diminui.
- Planalto: Não há mais produto acumulado.