O sequenciamento de DNA também depende da nossa capacidade de usar eletroforese em gel para separar filamentos de DNA que diferem em tamanho por um par de bases.
Sequenciamento de DNA
No final dos anos 70, duas técnicas de sequenciamento de DNA para moléculas de DNA mais longas foram inventadas. Estes foram o método Sanger (ou didesoxi) e o método Maxam-Gilbert (clivagem química). O método Maxam-Gilbert é baseado na clivagem específica de nucleotídeos por produtos químicos e é melhor usado para sequenciar oligonucleotídeos (polímeros de nucleotídeo curtos, geralmente menores que 50 pares de bases de comprimento). O método Sanger é mais comumente usado porque se provou tecnicamente mais fácil de aplicar e, com o advento da PCR e da automação da técnica, é facilmente aplicado a longas cadeias de DNA, incluindo alguns genes inteiros. Esta técnica baseia-se na terminação da cadeia por didesoxinucleótidos durante as reacções de alongamento por PCR.
Método Sanger
No método de Sanger, a fita de DNA a ser analisada é usada como molde e a DNA polimerase é usada, em uma reação de PCR, para gerar cadeias complementares usando primers.
Preparam-se quatro misturas reaccionais de PCR diferentes, cada uma contendo uma determinada percentagem de análogos de didesoxinucleótido trifosfato (ddNTP) para um dos quatro nucleótidos (ATP, CTP, GTP ou TTP). A síntese da nova fita de DNA continua até que um desses análogos seja incorporado, momento em que a fita é prematuramente truncada.
Cada reação de PCR terminará contendo uma mistura de diferentes comprimentos de fitas de DNA, todas terminadas com o nucleotídeo que foi didesoxi marcado para aquela reação. A eletroforese em gel é então usada para separar os filamentos das quatro reações, em quatro faixas separadas, e determinar a sequência do modelo original com base nos comprimentos de filamentos que terminam com o nucleotídeo.
Na reação automatizada de Sanger, são usados primers rotulados com quatro tags fluorescentes coloridas diferentes. As reaces de PCR, na presen dos diferentes didesoxi nucleidos, s realizadas como descrito acima. No entanto, a seguir, as quatro misturas reaccionais são então combinadas e aplicadas a uma única faixa de um gel. A cor de cada fragmento é detectada usando um feixe de laser e a informação é coletada por um computador que gera cromatogramas mostrando picos para cada cor, a partir dos quais a sequência de DNA molde pode ser determinada.
Normalmente, o método de sequenciamento automatizado é preciso apenas para seqüências de até um máximo de cerca de 700-800 pares de bases de comprimento. No entanto, é possível obter sequências completas de genes maiores e, de fato, genomas inteiros, usando métodos passo-a-passo como o Primer Walking e o Shotgun Sequencing.
No Primer Walking , uma porção viável de um gene maior é sequenciada usando o método de Sanger. Novos iniciadores são gerados a partir de um segmento confiável da seqüência e usados para continuar o seqüenciamento da porção do gene que estava fora do alcance das reações originais.
O sequenciamento de shotgun envolve o corte aleatório do segmento de DNA de interesse em fragmentos de tamanhos mais adequados (gerenciáveis), o sequenciamento de cada fragmento e a organização das peças com base em seqüências sobrepostas. Esta técnica foi facilitada pela aplicação de software para organizar as peças sobrepostas.