Medição da cinética enzimática
Como pano de fundo, as enzimas são proteínas que atuam como catalisadores na redução da quantidade de energia de ativação para que uma reação ocorra. A energia de ativação é a energia necessária para obter reações "iniciadas", já que muitas reações não ocorrem muito rapidamente (ou ocorrem) se são termodinamicamente possíveis.
Enzimas catalisam reações específicas em um local específico (conhecido como o sítio ativo) onde os reagentes se ligam e reagem para gerar os produtos. Os substratos têm locais ativos que são específicos apenas para eles, de modo que nenhuma outra substância se liga ou reage no mesmo local. Como uma fechadura e chave, cada enzima catalisa apenas uma reação específica (com algumas exceções).
A atividade específica é usada em métodos de isolamento de proteína para indicar a porcentagem de purificação. É importante conhecer esta unidade ao comprar enzimas para indicar exatamente quanto da enzima pura você está recebendo.
Ao medir a cinética enzimática (a taxa de reação de uma enzima com um substrato - ou superfície), a atividade específica é definida como a quantidade de substrato que a enzima converte (reações catalisadas) por mg de proteína na preparação enzimática por unidade de tempo.
Um exemplo de atividade específica seria:
- A actividade específica da enzima isolada foi medida a 150 µmoles / min / mg de proteína antes da purificação e 800 µmoles / min / mg, após purificação.
A atividade específica é uma medida importante da pureza da enzima. Diferentes lotes de uma enzima pura devem ter os mesmos valores e mesmo diluir uma solução enzimática muitas vezes terão valores de atividade específicos idênticos, embora haja diferentes valores de atividade enzimática. Isso ocorre porque, no cálculo da atividade específica, o numerador (unidades / ml) e o denominador (mg / ml) são afetados igualmente.
A atividade específica é muito diferente da atividade, mas o cálculo da atividade específica ainda depende do valor da atividade. Isso significa que o valor da atividade específica indicada também dependerá da definição da unidade de enzima.
Lotes de enzimas que têm um valor de actividade específico inferior ao esperado podem conter moléculas de enzima que se tornaram alteradas ou misturadas com impurezas.
Fatores que afetam a atividade da enzima
É possível que uma enzima possa ter diferentes valores de atividade medidos quando medida em diferentes laboratórios (isto é, diferenças reais na atividade medida, diferenças não aparentes causadas pelo uso de diferentes definições de unidade).
A maneira como um ensaio é realizado (o método de teste para determinar a pureza das enzimas) influenciará os valores de atividade relatados. Por exemplo, as enzimas são geralmente mais ativas entre temperaturas de 37 graus Celsius em comparação com 20 graus Celsius, então se um ensaio for realizado a 21 graus Celsius, os valores serão diferentes dos ensaios conduzidos a uma temperatura de 32 graus Celsius (tipicamente , os ensaios são realizados a uma temperatura entre 20-37 graus Celsius).
Assim, a definição da unidade enzimática seria melhor expressa como 1 unidade (U) é a quantidade de enzima que catalisa a reação de 1 nmol de substrato por minuto sob condições padrão.