O grau de pureza proteica requerido depende do uso final pretendido da proteína.
Para algumas aplicações, um extrato bruto é suficiente. No entanto, para outros usos, como em alimentos e produtos farmacêuticos, é necessário um alto nível de pureza. Para conseguir isto, utilizam-se tipicamente vários métodos de purificação de proteínas, numa série de etapas de purificação.
Cada etapa de purificação de proteínas geralmente resulta em algum grau de perda do produto. Portanto, uma estratégia ideal de purificação de proteínas é aquela em que o nível mais alto de purificação é alcançado no menor número de etapas. A selecção dos passos a utilizar depende do tamanho, carga, solubilidade e outras propriedades da proteína alvo. As seguintes técnicas são mais apropriadas para purificar uma única proteína citosólica. A purificação de complexos proteicos citosólicos é mais complicada e geralmente requer que métodos diferentes sejam aplicados.
Primeiros Passos para a Purificação de Proteínas
O primeiro passo na purificação das proteínas intracelulares (dentro da célula) é a preparação de um extrato bruto .
O extrato conterá uma mistura complexa de todas as proteínas do citoplasma da célula e algumas macromoléculas adicionais, cofatores e nutrientes. O extrato bruto pode ser usado para algumas aplicações em biotecnologia, no entanto, se a pureza é um problema, as etapas subseqüentes de purificação devem ser seguidas.
Os extractos de proteína bruta são preparados por remoção de detritos celulares gerados por lise celular, o que é conseguido utilizando produtos químicos e enzimas , sonicação ou uma prensa francesa. Os detritos são removidos por centrifugação e o sobrenadante é recuperado. Preparações em bruto de proteínas extracelulares podem ser obtidas simplesmente removendo as células por centrifugação.
Para certas aplicações biotecnológicas , existe uma demanda por enzimas termoestáveis : Enzimas que podem tolerar altas temperaturas sem desnaturar e, ao mesmo tempo, manter uma atividade específica alta. Organismos que os produzem são às vezes chamados extremófilos. Uma abordagem fácil para purificar uma proteína resistente ao calor é desnaturar as outras proteínas na mistura por aquecimento, depois arrefecendo a solução (permitindo assim que a enzima termoestável se reforma ou redissolve, se necessário. As proteínas desnaturadas podem então ser removidas por centrifugação.
Etapas Intermediárias de Purificação
No passado, um segundo passo comum para purificar uma proteína de um extrato bruto era por precipitação em uma solução com alta força osmótica (isto é, soluções salinas). Os ácidos nucleicos no extrato bruto podem ser removidos precipitando agregados formados com sulfato de estreptomicina ou sulfato de protamina.
A precipitação de proteínas é geralmente feita usando sulfato de amônio como o sal.
Diferentes proteínas irão precipitar em diferentes concentrações de sulfato de amônio . Em geral, proteínas de maior peso molecular precipitam em menores concentrações de sulfato de amônio. A precipitação de sais não costuma levar a uma proteína altamente purificada, mas pode auxiliar na eliminação de algumas proteínas indesejáveis em uma mistura e na concentração da amostra. Os sais na solução são então removidos por diálise através de tubos de celulose porosa, filtração ou cromatografia de exclusão em gel.
Os modernos protocolos de biotecnologia geralmente aproveitam os muitos kits disponíveis comercialmente que fornecem soluções prontas para procedimentos padrão. A purificação de proteínas é frequentemente realizada usando filtros e colunas preparadas de filtração em gel. Tudo o que você precisa fazer é seguir as instruções e adicionar o volume correto da solução correta e aguardar o período de tempo especificado ao coletar o eluente (que sai da outra extremidade da coluna) em um novo tubo de teste.
- Métodos cromatográficos podem ser aplicados usando colunas de bancada ou equipamentos de HPLC automatizados. A separação por HPLC pode ser feita por métodos de fase reversa, troca iônica ou exclusão de tamanho, e amostras detectadas por arranjo de diodos ou tecnologia laser. Detalhes
Visualização de Proteína e Avaliação de Purificação
- Cromatografia de fase reversa (RPC) separa proteínas com base em suas hidrofobias relativas. Essa técnica é altamente seletiva, mas requer o uso de solventes orgânicos. Algumas proteínas são permanentemente desnaturadas por solventes e perdem a funcionalidade durante o RPC. Portanto, este método não é recomendado para todas as aplicações, particularmente se for necessário que a proteína alvo retenha a atividade.
- A cromatografia de troca iônica refere-se à separação de proteínas com base na carga . As colunas podem ser preparadas para troca aniônica ou troca de cátions. As colunas de troca aniônica contêm uma fase estacionária com uma carga positiva que atrai proteínas carregadas negativamente. As colunas de permuta catiica s as pulas inversas carregadas negativamente que atraem proteas carregadas positivamente. A eluio da (s) protea (s) alvo (s) feita por alterao do pH na coluna, o que resulta numa alterao ou neutralizao dos grupos funcionais carregados de cada protea.
- A cromatografia por exclusão de tamanho ( filtração em gel ) separa as proteínas maiores das pequenas, uma vez que as moléculas maiores viajam mais rapidamente através do polímero reticulado na coluna de cromatografia. As proteínas grandes não se encaixam nos poros do polímero, enquanto as proteínas menores, e levam mais tempo para percorrer a coluna de cromatografia, através de sua rota menos direta. O eluato é coletado em uma série de tubos que separam as proteínas com base no tempo de eluição. A filtração em gel é uma ferramenta útil para concentrar uma amostra de proteína, uma vez que a proteína alvo é coletada em um volume de eluição menor do que o inicialmente adicionado à coluna. Técnicas semelhantes de filtração podem ser usadas durante a produção de proteínas em larga escala devido à sua relação custo-benefício.
- A cromatografia por afinidade é uma técnica muito útil para "polir" ou completar o processo de purificação de proteínas. As pérolas na coluna de cromatografia são reticuladas com ligandos que se ligam especificamente à proteína alvo. A proteína é então removida da coluna enxaguando com uma solução contendo ligandos livres. Este método fornece os resultados mais puros e a atividade específica mais alta em comparação com outras técnicas.
- SDS-PAGE é uma electroforese em gel de poliacrilamida, realizada na presença de SDS (dodecilsulfato de sódio) que se liga a proteínas, dando-lhes uma grande carga negativa líquida. Como as cargas de todas as proteínas são bastante iguais, esse método as separa quase inteiramente com base no tamanho. A SDS-PAGE é freqüentemente usada para testar a pureza da proteína após cada etapa de uma série. À medida que as proteínas indesejadas são gradualmente removidas da mistura, o número de bandas visualizadas no gel de SDS-PAGE é reduzido, até que haja apenas uma banda representando a proteína desejada.
- Imunoblotting é uma técnica de visualização de proteínas aplicada em combinação com cromatografia de afinidade. Anticorpos para uma proteína específica são usados como ligantes em uma coluna de cromatografia de afinidade. A proteína alvo é retida na coluna, depois removida enxaguando a coluna com uma solução salina ou outros agentes. Anticorpos ligados a marcadores radioativos ou corantes auxiliam na detecção da proteína alvo, uma vez separada do restante da mistura.
Fontes:
Zubay G. 1988. Bioquímica, 2a edição. Macmillan Publishing Co., Nova Iorque, NY, EUA.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Purification Purification Handbook, Edição AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. Nova Jersey, EUA. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.